Zu dieser Zeit hatte bereits Spanien die Kurpfalz ins Visier genommen. Im selben Jahr war Spanien in den Krieg eingetreten mit der Absicht, die Kurpfalz zu erobern. Die Region war Station auf dem Weg von Italien in die spanischen Niederlande („Die Spanische Straße“). Auch Spanien war katholisch und unterstützte den Kaiser des Heiligen Römischen Reichs gegen die protestantischen Rebellen. Im August 1620 zog Don Ambrosio Spinola (Ambrogio Spinola Doria, 1st Marquess of Los Balbases) als Befehlshaber der kaiserlichen Armee in Flandern, von den Spanischen Niederlanden an der Spitze von 23.000 Soldaten nach Süden, wandte sich in Höhe Mainz nach Osten und marschierte auf Frankfurt zu. 1569 in Genua geboren, war Spinola 1599 in die Dienste König Philipps III. von Spanien eingetreten und rasch zu einem führenden Feldherrn aufgestiegen, der auch diesmal sein militärisches Genie unter Beweis stellte. Er ließ Frankfurt sprichwörtlich links liegen und ließ nach Süden marschieren. Die Unionstruppen in Oppenheim fürchteten um die Sicherheit ihrer Stützpunkte in Worms und Frankenthal und entsandten Truppenkontingente nach Süden. Als sich Spinolas Manöver als Ablenkung erwies, wurden sie wieder zurück beordert. Die pfälzische Schutztruppe glich eher einem Hühnerhaufen als einer taktisch geschulten und professionell befehligten Einheit. Schließlich schlug Spinola sein Lager oberhalb von Nierstein auf, während Joachim Ernst sich mit den Seinen in Oppenheim verschanzte. Im August unternahmen die Spanier zahlreiche Kommandounternehmen im heutigen Rheinhessen, nahmen Städte und Dörfer ein und zogen sich wieder zurück. Die Unionstruppen blieben untätig und zogen schließlich aus Oppenheim ab, als sie fürchten mussten, von Worms und Frankenthal abgeschnitten zu werden und die pfälzischen Kernlande dann den Spaniern völlig ausgeliefert gewesen wären.

Spinola marschierte daraufhin umgehend nach Oppenheim. Die spanische Eroberung Oppenheims fand dann am 14. September 1620 statt, was den protestantischen Streitkräften in den für sie ohnehin schwierigen Anfangsjahren des Dreißigjährigen Krieges einen weiteren schweren Schlag versetzte. Die geschrumpfte protestantische Garnison mit gerade noch 800 pfälzischen Musketieren, die sich einer beeindruckenden Streitmacht gegenüber sah, gab ihre Verteidigung ohne zu zögern auf und kapitulierte. Oppenheim wurde eingenommen, die pfälzischen Soldaten wurden entwaffnet, aber freigelassen. Neben mehreren Flaggen beschlagnahmten die Spanier lediglich das Gepäck und die Waffen.

Das Hauptziel von Spinolas Truppen war es gewesen, eine Stadt einzunehmen, die es ihnen ermöglichte, Quartier, Vorräte und Munition zu sichern und sich so auf den Winter 1620/21 vorzubereiten. Die Aufmerksamkeit des Marquess hatte sich auf Oppenheim konzentriert, weil ihre Brücke den Eingang zum Herzen der Kurpfalz bewachte. Die Stadt war durch starke Befestigungen geschützt, die wegen der kampflosen Übergabe keinen Schaden genommen hatten.

Die zerstörte Rheinbrücke ließ Spinola wieder aufbauen um für militärische Bewegungen flexibel zu sein und Nachschub anlanden zu lassen. Die Region zwischen Rhein und Pfalz ließ er mit zahlreichen kleineren Garnisonen besetzen und nahm selbst Residenz in Oppenheim. Am 25. September gab es eine Konferenz der Führungsoffiziere der spanischen Armee, und an diesem Tag erfuhr man, dass die protestantische Kavallerie einen Angriff vorbereitete. Spinola beorderte Graf Hendrik van den Bergh, der 2.200 Kavalleristen und 3 Kanonen befehligte, den Angriff der Union abzuwehren, der dann aber nicht stattfand.

Zu Beginn des Winters zogen sich die gegnerischen Armeen in ihre Garnisonen zurück. Die Protestanten erhielten Verstärkung aus England, angeführt von Sir Horace Vere. In den folgenden sechs Monaten eroberten die Spanier trotzdem mehr als 30 Städte und Burgen in der Kurpfalz. In Oppenheim setzten sie sich fest bis 1631 und führten elf lange Jahre unter Spinolas Nachfolgern ein strenges und für die Bürger leidvolles Regiment. Spinola setzte seine militärische Karriere schon 1621 in den Niederlanden, später in Italien fort. Er starb im Piemont 1630. In Oppenheim folgten auf die Schweden, die unter König Gustav Adolf die Spanier vertrieben hatten, bereits 1637 erneut eine spanische Besatzung für weitere sieben Jahre. Es folgten bayerische, thüringische und noch einmal spanische Besatzungen. In den letzten Kriegsjahren vor dem Westfälischen Frieden von 1648 gaben Franzosen die Kommandos. Der Landesherr Oppenheims, der fast dreißig Jahre vorher maßgeblich mitverantwortlich war, dass die Stadt Oppenheim Kriegsschauplatz wurde, der pfälzische Kurfürst und sogenannte Winterkönig Friedrich V., war schon am 29. November 1632, zwei Wochen nach Gustav Adolf, gestorben. Seine Hoffnung, mit Hilfe des Schwedenkönigs seine Herrschaft in der Kurpfalz und damit auch über Oppenheim wieder zu erhalten, erfüllte sich nicht. Oppenheim wurde die zweifelhafte Ehre zuteil Grabstätte für die inneren Organe des toten Fürsten zu werden. Sie wurden im Westchor der Katharinenkirche beigesetzt, während der Sarg mit dem Leichnam wochenlang durch die Pfalz und das angrenzende Frankreich irrte, bis er schließlich irgendwo zwischen Metz und Sedan ankam, wo sich seine Spur verliert.