Aus Sebastian Münsters Kind- und Jugendzeit ist nicht besonders viel bekannt, allerdings lässt sich durch die Auswertung verschiedener Kalendarien Münsters sein Geburtsdatum eindeutig bestimmen. Am 20. Januar 1488 wurde Sebastian Münster als zweiter Sohn eines Spitalmeisters in Nieder-Ingelheim geboren.  Über seine Familiengeschichte lässt sich ebenfalls wenig sagen, allerdings ist sicher, dass ein Jakob Münster 1464 Kirchenmeister in Ober-Ingelheim war und es sich offensichtlich um einen Onkel seines Vaters gehandelt hat. Außerdem sind sein Vater und sein Bruder bekannt: Andreas und Hans Münster. Hans Münster hatte zwei Söhne, die später bei Johannes lernten und dann Ratsherr in Lüneburg beziehungsweise Pfarrer in Neckar-Bischofsheim wurden. Aufgrund der hohen Stellung seines Vaters und dessen Onkels, lässt sich vermuten, dass Sebastian Münster in seiner Kindheit schon ein gewisses Maß an Bildung erfuhr. Außerdem geben die Ingelheimer Gerichtsbücher einen Einblick in den Besitz der Familie, der nicht unbeträchtlich gewesen ist. In dieser gehobenen sozialen Stellung verbrachte Münster seine Kindheit. Ein Aufenthalt in Mainz im Jahr 1501 ist das einzige dokumentierte Jugenderlebnis.

1505 mit siebzehn Jahren trat Münster dem Franziskanerorden bei und begab sich zum Studium nach Heidelberg. Hier wurden die sieben freien Künste der Grammatik, Rhetorik und Dialektik (Trivium) und dann Musik, Astronomie, Arithmetik und Geometrie (Quatrivium) betrieben. Die Ordensoberen schickten den außergewöhnlich sprachbegabten Studenten zunächst nach Löwen (1507) und dann nach Freiburg im Breisgau. Dort begeisterte er sich vor allem für Hebräisch und Geographie. Im Jahre 1509 wurde Münster von seinem Orden nach Rufach (Oberelsass) zu Konrad Pelikan geschickt. Münster wurde sein Schüler und bildete sich in Griechisch, Hebräisch, Mathematik, Astronomie und Geographie weiter. 1511 folgte er seinem Lehrmeister Pelikan nach Basel und 1512 nach Pforzheim. Während dieser Stationen erweiterten die beiden ihre Studien auch auf andere Sprachen, vor allem das Aramäische und das Äthiopische. 1514 verließ Münster Pelikan für vier Jahre, um in Tübingen Lektor der Ordensschule der Franziskaner zu werden. Hier setzte er seinen astrologischen Studien unter dem berühmten Astronomen Johannes Stöffler, „Vater der Wissenschaften“ genannt, fort. Außerdem betrieb er in Tübingen Mathematik, Kartographie und Geographie.

Ab 1518 lehrte er wieder an der Ordensschule in Basel und von 1521-1529 in Heidelberg, wo ihn Kurfürst Ludwig V. 1524 zum Professor für Hebräisch an der Universität Heidelberg beruft. Bereits 1520 erschien Münsters erste wissenschaftliche Arbeit, eine hebräische Grammatik, die eine praktische Einführung in das Sprachstudium darstellte. 1529 wurde Münster auf den durch Pelikans Fortgang verwaisten, Lehrstuhl für Hebraistik nach Basel berufen, das sich soeben der Reformation angeschlossen hatte. In vier Tagesreisen begab er sich ohne die Erlaubnis seines Ordens nach Basel und trat dort erst aus ihm aus. Von seiner Pflicht als katholischer Pfarrer entbunden, heiratete er 1530 Anna Selber, die er schon von seinen vorigen Aufenthalten in Basel kannte. Am 24. November 1532 gebar Anna ihm sein einziges Kind, ein Mädchen, welchem er den seltenen hebräischen Namen Aretia gab. Ihre Lebenszeit ist nicht bekannt, die letzte Nachricht von ihr stammt aus dem Jahre 1580.

Münster arbeitete unermüdlich weiter und so erschien 1534/1535 eine vollständige hebräische Ausgabe des Alten Testaments, mit einem umfangreichen Kommentar, die Münsters bedeutendste wissenschaftliche Leistung auf dem Fachgebiet der Hebraistik darstellt.  Es folgten viele Reisen nach Frankreich, in die Schweiz, nach Schwaben und Bayern. Auf diesen Reisen sammelte er für das Werk, das ihm später seinen größten europäischen Ruhm zutragen sollte: Die Kosmographie. Es geht in ihr um eine Zusammenfassung des Wissens der Welt in deutscher Sprache. Ihre Themen reichen von Geschichte und Geographie über Astronomie und Naturwissenschaften bis hin zu Landes- und Volkskunde. Es ist das erste deutsche Werk dieser Art. Die Kosmographie erschien 1544. Ihre Übersetzungen, Neuauflagen und Erweiterungen beschäftigten ihn von nun an für den Rest seines Lebens. Ihr großer Erfolg spiegelt sich auch in der Menge ihrer Übersetzungen wieder. 1550 übersetzte er das Werk ins Lateinische, 1552 erschien eine französische Ausgabe in Basel, 1554 wurde dass Werk sogar ins Tschechische übersetzt und 1558 folgte eine italienische Ausgabe.

Mitte Mai 1552 erlitt Sebastian Münster einen Ohnmachtsanfall, den er zunächst nicht ernst nahm. Wenige Tage später folgte ein schwerer Hautausschlag, der sich als Folge der Pest herausstellte. Sebastian Münster verstarb mit 64 Jahren am 26. Mai 1552 gegen 8.00 Uhr morgens. Am nächsten Tag den 27. Mai 1552 fand das Begräbnis statt, zu dem sich nicht nur viele Freunde und Bekannte, sondern auch die Spitze der Baseler Universität einfand. Auf seinem Grabmal im Baseler Münster wird er als „deutscher Strapo“ bezeichnet.