Johannes Gensfleisch, nach dem Namen seines Familiensitzes „zum Gutenberg" genannt, wurde um das Jahr 1400 als Sohn des patrizischen Kaufmanns Friedrich „Friele“ Gensfleisch zur Laden und dessen zweiter Frau Else Wirich in Mainz geboren. Über seine Kindheit selbst ist sehr wenig bekannt, jedoch kann aufgrund seiner guten Lateinkenntnisse und seines unternehmerischen Geschicks von einer umfassenden (Schul-)Bildung ausgegangen werden. So ist es auch möglich, dass Gutenberg an der Universität Erfurt studierte, dies gilt jedoch nicht als gesichert. Da sich in den Jahren 1418/1419 ein Student unter dem Namen „Johannes de Alta villa“ immatrikulierte und es damals üblich war, den Herkunftsort dem Vornamen beizufügen, ist es möglich, dass hierbei der zeitweise in Eltville ("Alta villa") lebende Johannes Gutenberg gemeint ist. Zu Gutenbergs Jugendzeit befand sich Mainz in einer schweren Krise. Nicht nur dass die Stadt hoch verschuldet war und immer noch mit den Nachwirkungen der Pest zu kämpfen hatte, sondern beschuldigten sich auch Patrizier und  Zünfte, die die Führungsschicht der Stadt bildeten, gegenseitig, für die desolate Lage verantwortlich zu sein. Aus Protest verließ deshalb ein Teil der patrizischen Bevölkerung die Stadt, zunächst für einen befristeten Zeitraum. So auch Friele Gensfleisch, der 1411 und 1413 für kurze Zeit Mainz den Rücken kehrte und zusammen mit seiner Familie nach Eltville zog. Nach dem Tod seines Vaters 1419 gerieten Gutenberg und seine Geschwister mit der Tochter seines Vaters aus erster Ehe, in einen Rechtsstreit um das Erbe. Im Jahr 1428 entbrannte der Streit der politischen Führungsschicht erneut, und mehrere Patrizierfamilien mussten die Stadt verlassen. Dazu gehörten wahrscheinlich auch Johannes Gutenberg und seine Familie.

Über seinen Verbleib 1429 bis 1434 sind keine Informationen überliefert, außer einer Urkunde mit namentlicher Erwähnung von 1430, die Gutenberg die Erlaubnis zur Rückkehr in seine Heimat aussprach. Als 1433 seine Mutter Else starb, wurde das Erbe unter Gutenberg und seinen Geschwistern aufgeteilt.

Ab 1444 ist Gutenbergs Aufenthaltsort unbekannt, bis er 1448 in seiner Heimatstadt Mainz wieder auftauchte und einen Kredit von 150 Gulden zu 5% Zinsen aufnahm, den er wahrscheinlich für die Weiterentwicklung seiner Erfindung verwendete. Im Jahr 1450 ging Johannes Gutenberg eine Geschäftspartnerschaft mit Johannes Fust ein, der ihm zuerst 800 Gulden lieh und sich 1453 mit einer Zahlung von weiteren 800 Gulden an dem gemeinsamen Projekt, dem „Werk der Bücher“ wie es später genannt wurde, beteiligte. Mit diesem Geld konnte Gutenberg seine Entwicklung einer Druckerpresse, sowie ein Druckverfahrens mit beweglichen Lettern fertigstellen, sodass er mit dem Druck eines Gedichts über das Weltgericht in deutscher Sprache eines seiner frühesten Werke abschließen konnte[Anm. 1]. Gutenbergs Ziel war es dabei, die Merkmale einer schönen Handschrift auf seine Drucke zu übertragen, weshalb er über 280 verschiedene Schriftzeichen schuf. In einer vermutlich dreijährigen Arbeitszeit von 1452-1454 druckte er sein Meisterwerk, die 42-zeilige Bibel in lateinischer Sprache, die heute noch unter der Bezeichnung Gutenbergbibel oder B 42 (B für Bibel, 42 für die 42 Zeilen auf einer Seite) bekannt ist. Diese umfasste 1282 Seiten in typografischer Vollendung[Anm. 2] und hatte eine Auflage von etwa 180 Stück[Anm. 3] (150 Stück auf Papier, etwa 30 Stück auf dem teureren Pergament), so Enea Silvio Piccolomini (später Papst Pius II.) 1455 in seinem Brief an Kardinal Juan de Caravajal. Die 42-zeilige Bibel wurde 1454 auf der Messe in Frankfurt präsentiert und verkauft, die damals wie heute als einer der großen Namen im Bereich Messen und Literatur gilt. Die schon zu dieser Zeit große internationale Ausstrahlung Frankfurts als Messeort und Umschlagplatz für Fernhandel, wurde von Gutenberg wahrscheinlich mit Absicht für den Vertrieb seiner Bibeln gewählt, da so die Werbung verbreitet und der Verkauf angeregt wurden.

1455 sorgten finanzielle Streitigkeiten für einen Bruch zwischen Gutenberg und seinem Geschäftspartner Fust. So verklagte Fust Gutenberg wegen ausbleibender Zinsen und Geldrückzahlungen, was in dem sogenannten Helmasperger Notariatsinstrument überliefert wurde. Ein weiterer Grund soll gewesen sein, dass Gutenberg das angelegte Kapital nicht für das gemeinsame „Werk der Bücher“ verwendet haben soll, sondern zur gleichen Zeit mit anderen Projekten beschäftigt war. Gutenberg hingegen verwies auf die auch von ihm getätigten großen Investitionen bei der Herstellung der B 42. Über den genauen Ausgang des Prozesses ist nichts bekannt. Jedoch wird vermutet, dass das Gericht Fust Teile der Gerätschaften zusprach, die mithilfe seiner ersten Zahlung finanziert worden waren, sowie große Teile der Bibelauflage. Denn Fust betrieb nach diesem Rechtstreit zusammen mit seinem späteren Schwiegersohn und ehemaligen Mitarbeiter Gutenbergs Peter Schöffer die Druckerei weiter.

Einige Zeit später begann Gutenberg wahrscheinlich eine neue Geschäftspartnerschaft mit dem Juristen Konrad Humery, mit dessen Hilfe er eine neue Druckerwerkstatt aufbaute. 1462 wurde Mainz während der sogenannte Mainzer Stiftsfehde von dem vom Papst unterstützen Erzbischof Adolf von Nassau erobert. Die Stadt wurde geplündert und teilweise durch Brände zerstört. Viele Bürger wurden aus der Stadt vertrieben und ihre Höfe an Befürworter des Erzbischofs verteilt, so wahrscheinlich auch der des Johannes Gutenberg. Doch schon im Jahr 1465 kehrte Gutenberg nach Mainz zurück und wurde von demselben Erzbischof zum Hofmann ernannt. In dieser Position erhielt er angemessene höfische Kleidung, sowie Getreide- und Weinspenden und Steuerfreiheit. Johannes Gutenberg starb am 03.02.1468 im Hof zum Algesheimer in Mainz und wurde in der (heute zerstörten) Franziskanerkirche beerdigt. Seine Druckwerkstatt ging an seinen Geschäftspartner Konrad Humery unter einer Auflage: Sie durfte nur in Mainz zum Einsatz kommen.