Die Bestimmmung des Augsburger Religionsfriedens im Jahr 1555 hatte weitreichende Konsequenzen für die Stadt. Zwar kam für die Reichsstädte keine Neuregelung zustande - sie sollten beim status quo bleiben - aber die Zubilligung des ius reformandi für die Territorialfürsten hatte Auswirkungen. Die Stadt war seit 1375 an die Kurpfalz verpfändet, so dass der Landesherr Kurfürst Ottheinrich seine Hoheitsrechte auch in Oppenheim wahrnehmen wollte: er befahl dem städtischen Rat 1557 die Einführung des lutherischen Glaubens.

Dieser weigerte sich, man kam jedoch zu dem Kompromiss, lutherische Pfarrer einzustellen, was kein Bruch mit der Festsetzung des status quo von 1555 bedeutete, da wohl zuvor schon protestantische Prediger in der Stadt gewirkt hatten. Die reformatorische Bewegung erstarkte in Oppenheim:  1557 wirde der lutherische Theologe Adam Gelphius Rektor der Lateinschule, über das Schulwesen wurde auch die Stadt evangelisch. Es kam jedoch alsbald zu Protesten einflussreicher katholischer Bürger sowie des ortsansässigen Franziskanerordens - Gelphius wurde seines Amtes enthoben. Doch die Zeiten hatten sich geändert, der steigende Einfluss der Protestanten konnte nicht mehr ignoriert werden.

Unter Friedrich III. (Kurfürst 1559-1576), selbst Anhänger der von Zwingli und Bucer vertretenen Glaubensrichtung, wurden einschneidende Reformen umgesetzt. Lutherische Pfarrer und Rektoren wurden ihres Amtes enthoben, bei einem persönlichen Besuch in Oppenheim im Mai 1565 erschien Friedrich mit dem neuen, reformierten Pfarrer Burkhard Weber. Nach einer Disputation mit den Theologen und Amtsträgern vor Ort entließ er einen großen Teil der Amtsträger, wenige verbliebene Ratsherren mussten die kurfürstlichen Befehle umsetzen, u.a. Pflicht zur Teilnahme am Gottesdienst, weniger Glockengeläut, theologische Umerziehung und nicht zuletzt die Aufforderung zum 'Bildersturm' und zur Zerstörung anderer 'Götzen' - ein Teil der kostbaren Fenster und sakralen Geräte konnten jedoch gerettet werden. Mit seinen 'Verbesserungsvorschlägen' richtete sich die Politik des Kurfürsten gegen die Konkurrenten aus dem eigenen protestantischen Lager, die Lutheraner, weniger gegen die Katholiken.

Das Kloster Mariacron wurde in ein weltliches Damenstift umgewandelt, die Aufnahme neuer Stiftsdamen wurde verboten - mit dem Tod der letzten Nonne 1585 erlosch das Stift.

Nach dem erzwungenen Konfessionswechsel zum reformierten Glauben begingen Lutheraner und Katholiken einen Schulterschluss und überreichten im Mai 1566 eine Bittschrift an den Kaiser, den Missständen Abhilfe zu schaffen. Der Kaiser unterstützte deren Anliegen, doch gelang es den pfälzischen Kurfürsten mithilfe der Räte, die Stadt für den reformierten Glauben zu halten.