Die Gründung einer Universität war eine der ersten Maßnahmen, nachdem sich der Erzbischof als Stadtherr endgültig durchgesetzt hatte. Schon Adolf von Nassau hatte sich (vergeblich) um die päpstliche Erlaubnis zur Gründung einer Universität bemüht. 1476 gestattete der Papst Diether von Isenburg die Einrichtung eines "Studium generale" in Mainz. Die Mainzer Universität konnte am 1. Oktober 1477 feierlich eröffnet werden.
Zunächst unterrichtete man in vier Fakultäten: Theologie, Jura, Medizin und Artistik (heute Philosophie). Studenten und Professoren wohnten gemeinsam in so genannten Bursen, die der Erzbischof der Universität zur Verfügung stellte. Dabei handelte es sich um ehemalige Patrizierhäuser (Hof zum Gutenberg, Hof zum Algesheimer, Hof zum Schenkenberg), die nach der Erzstiftsfehde in den Besitz des Erzbischofs gekommen waren.
Nach Luthers Thesen von 1517 entbrannte in Mainz ein heftiger Lehrstreit. Diesen entschied der 1534 von Ignatius von Loyola gegründete und vom Mainzer Erzbischof nach Mainz gerufene Jesuitenorden im Sinne der traditionellen katholischen Lehre. Bis zur (vorläufigen) Aufhebung des Ordens im Jahre 1773 bestimmten die Jesuiten die Lehrinhalte der Universität.